本发明公开了一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用。该方法及其试剂盒通过三重PCR反应，经电泳染色、紫外观察，能同时检出stx1、stx2、wzy_O157基因，且stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型，stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株。本发明能有效检测出stx及其主要变种，可用于区分O157和其他非O157型大肠埃希氏菌，既可以用于直接检测食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌，也可以用于鉴定临床株和食品分离株。